以多巴(L-DOPA)为底物,柚皮测定酪氨酸酶的苷氢活性。先将待测样品用无水乙醇溶解,抗氧配制成质量浓度为1Mg/ML的化活贮备液,再依次稀释成不同浓度的性研样品溶液。按表2所示,柚皮依次准确吸取不同浓度的苷氢样品溶液,pH6.8的抗氧0.5MoL/L磷酸盐缓冲溶液,0.5MMoL/LL-DOPA溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶溶液,化活充分混匀,性研在37℃水浴锅中孵育反应30MiN,柚皮然后立即测定各试管中反应溶液在475NM处的苷氢吸光值。上述试验均重复3次。抗氧根据酶反应活性的化活定义,在一定的性研抑制剂浓度下,酶反应活性表示为ACTi,在没有抑制剂时酶反应活性表示为ACT0,则受试样品对酶的相对抑制率(I)可以定义为: 式中,ACTi—有抑制剂时的酶反应活性;ACT0—没有抑制剂时的酶反应活性;A1,A2,A3,A4—1,2,3,4号反应液的吸光值。 1.2.7 B16黑色素瘤细胞细胞MTT试验称取50g重铬酸钾固体,以100ML蒸馏水100℃溶解(电炉加热),快速加入900ML浓H2sO4,混匀,冷却即可使用。MTT用PBs配制成质量浓度5Mg/ML,过0.22μM水相滤膜后存于10ML无菌离心管中,于-20℃冷冻保存。具体步骤: 1)取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷的标准品20Mg,加入DMsO溶解配成500MMoL/L的母液,过0.22μM有机滤膜后以每管20μL分装于无菌的200μL离心管中,于-20℃冷冻保藏。 2)不同浓度样品的配制分别取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷3种物质500MMoL/L的母液各4μL,加入4ML1640基础培养基中,配成500μMoL/L的溶液,然后分别稀释到250,125,62.5μMoL/L3个浓度。 3)96孔细胞培养板培养细胞在超净工作台中移取5ML75T细胞培养瓶终止消化后的细胞与培养液的混合液于离心管中,800r/MiN离心4MiN,弃上清液,移取3ML完全培养基于离心管并混匀细胞液,取上述1ML细胞液,加1ML完全培养基,取80μL于平板计数器计数,用完全培养基稀释调整细胞浓度为8000个细胞/100μL,用12通道移液枪将细胞液混匀,加入96孔细胞培养板,每孔加入100μL,做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h。 4)96孔细胞培养板中加入样品将上述96孔细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h,用废液真空泵吸弃细胞培养液,每孔加入不同浓度的样品150μL,并且每块96孔板都要留1到2列只加基础培养基做空白对照,做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养24h。 5)B16黑色素瘤细胞的MTT试验在超净工作台中,取PBs配成质量浓度5Mg/ML的MTT溶液,与基础培养基以体积比1∶9的比例配成MTT细胞培养液。将步骤4)中加样品培养24h后的细胞培养液用废液真空泵吸弃,每孔加入150μLMTT细胞培养液,做好标记后将细胞培养板放入CO2恒温培养箱培养4h,吸弃MTT细胞培养液,每孔加入150μLDMsO,于酶标仪中振动10MiN后测定波长490NM处的吸光度值。 细胞存活率=(A0-Ax)/A0×100% 式中,A0—不加样品的空白吸光度值;Ax—加不同浓度样品作用后的吸光度值。 1.2.8 B16黑色素瘤细胞HoeChsT荧光染色试验具体操作步骤:1)于超净工作台上,打开六孔板,置灭菌盖玻片。将细胞悬液滴加至盖玻片上,置CO2体积分数为5%的培养箱中,37℃培养至细胞固着(约2h),加入2ML细胞培养液继续培养约6h。弃培养基,用PBs洗3次,每次5MiN。 2)用4%多聚甲醛固定30MiN,PBs洗3次,每次5MiN。 3)切片稍甩干后在圈内滴加适量HoeChsT染液到爬片上,室温避光孵育15MiN。 4)PBs漂洗爬片3次,每次5MiN,从六孔板内取出爬片,将有细胞的一面封到滴加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上,荧光显微镜下观察并拍照。 1.2.9 NariNgiNDC与双孢蘑菇酪氨酸酶的分子对接采用CheMBioDrawULTra14.0画出化合物熊果苷和NariNgiNDC的结构,然后用CheMBio3DULTra14.0转化为三维结构,用MMFF94力场进行优化。双孢蘑菇酪氨酸酶的三维结构(PDBiD:2Y9X)从RCsB蛋白数据库下载。酪氨酸酶和化合物均使用AuTodoCkTooLs1.5.6转化为PDBQT格式。采用AuTodoCkviNa1.1.2进行分子对接。酪氨酸酶活性位点的坐标设置为:CeNTer_x=-10.044,CeNTer_y=-28.706,CeNTer_z=-43.443;size_x=15,size_y=15,size_z=15。为了增加计算的准确度,将参数exhausTiveNess设置为20。其它参数均用默认值。最后,选取打分值最高的构象用PyMoL1.7.6进行结果分析。 2 结果与讨论2.1 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素对ABTS自由基的清除效果以TroLox作为对照,以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=0.3627x+0.0661(R2=0.9943),研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4种样品对ABTs自由基清除效果,结果见图3。4种样品对ABTs自由基清除效果以TroLox的抗氧化物质的量表示,结果见表3。 由表3可知,4种样品对ABTs自由基均有清除作用。以TroLox作为对照,4种样品的总抗氧化能力结果中,柚皮苷的TroLox抗氧化物质的量为0.1748MMoL/g,NHDC为2.9109MMoL/g,NariNgiNDC为0.6986MMoL/g,槲皮素为39.6103MMoL/g。4种样品对ABTs自由基清除能力依次为槲皮素>NHDC>NariNgiNDC>柚皮苷。 2.2 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素对羟自由基的清除效果以TroLox为对照,以其浓度-吸光值绘制标准曲线y=4.0588x+0.079(R2=0.9998),研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4种样品对羟自由基清除效果,结果见图4。4种样品对羟自由基清除效果以TroLox的抗氧化物质的量表示,结果见表4。 由表4可看出,4种样品对羟自由基均有清除作用,试验中以TroLox作为对照,得到柚皮苷清除能力的TroLox物质的量为19.8μMoL/g,NariNgiNDC为31.9μMoL/g,NHDC为44.4μMoL/g,槲皮素为365.5μMoL/g。4种样品清除羟自由基能力依次为槲皮素>NHDC>NariNgiNDC>柚皮苷。 声明:本文所用图片、文字来源《中国食品学报》,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系 相关链接:柚皮苷,槲皮素,酪氨酸酶,磷酸盐 |
优路教育:教育不仅是知识的传授,更在于其间的温度我在全国人民面前社死了…图赫尔暴怒吃到黄牌!不满C罗明显越位却赢得角球霍华德本赛季第一次两双 曾经双20都不是个事老虎证券三季度净利同比增长超四倍,新增开户客户数却环比大跌优路教育:为人才提供多样化选择布克伤退太阳大举反击 普尔18分勇士半场落后阿里腾讯走到了命运转折点?接轨世界潮流!中国男篮转型后卫渐成核心位置沃格尔拒谈詹姆斯症状 已安排把他送回洛杉矶双层玻璃圆桌茶几怎么装 玻璃茶几有哪些安装方法,行业资讯环境空气VOCs气质法测定标准征求意见稿发布服务点对点!上海嘉定市场监管局助力防疫物资企业生产经营广西柳州市场监管局:3天让“五菱”口罩从想法变成现实彩绘在玻璃上会不会脱落 玻璃上绘画该用什么颜料,行业资讯玻璃绝缘子测量电阻大小 盘式绝缘子是哪种绝缘子,行业资讯陕西精准检测助力打赢疫情防控阻击战没买玻璃险也可以理赔吗 汽车玻璃哪些不可以理赔,行业资讯山东省市场监管局:餐饮服务提供者停止接办规模性聚餐活动上海崇明区严格管控家庭办酒 筑牢农村疫情防控战线红参多糖对小鼠抗氧化能力的研究草酸三氢钾pH溶液标准物质:优质实验室校准基准看好航天应用,美玻璃陶瓷厂家融入资金1200万美元,行业资讯打造健康舒适家,这些功能型板材你不可不知!最高被罚100万!河北公布第九批疫情防控期间违法典型案件8月淄博市有玻璃熔窑(炉)的企业,限产或限排15%,政策解读王建平:退休老党员的“新担当”水中丙酸溶液标准物质:精准测定水质中丙酸含量非法经营民宿拒退房费 厦门一民宿老板被拘留江苏旧房装修、厨卫改造补贴政策落地 最 高补贴3万元jnby by JNBY 婉转动听 吟唱童年美好应当保留部分非建材用格法超薄玻璃原片,行业资讯凌源超薄玻璃生产线项目开工建设,行业资讯虚假宣传药物疗效 北京密云一药店领到罚单啄木鸟童装 简约舒适 亮点时尚日常该如何在玻璃的中间割洞 玻璃刀怎么割固定的玻璃,行业资讯全国要点监测浮法玻璃企业六月快报数据综合统计显示: 价格环比上升,同比下降,产业数据中空玻璃是怎么做出来的 中空百叶玻璃具有的优点,行业资讯重庆:允许销售未在境内上市的医用口罩真菌Simplicilliumlanosoniveum色素的分离表征及培养基优化(一)